Области применения:
- Приготовление библиотек при проведении NGS на секвенаторах ДНК HiScan SQ, HiSeq 2000, MiSeq (Illumina). 5500 xl W, 5500w, Ion Torrent IonProton, Ion Torrent PGM (Life Technologies); GS FLX+, GS Junior (Roche).
- Подготовка образов для парноконцевого секвенирования, ChIP-секвенирования.
- Улучшение библиотек при проведении эмульсионной ПЦР с помощью систем QX100 и QX200 с автоматической системой генерации капель (Bio-Rad).
- Выделение НК и белков.
Принцип работы:
В системе используются готовые картриджи на пять изолированных капилляров, заполненных агарозным гелем разной процентной концентрации, которая выбирается пользователем в зависимости от величины фрагмента образца. В конце каждого капилляра имеется Y-образное разветвление. Оба выходящих капилляра имеют независимое подключение к катодам. Движение фрагментов ДНК в капилляре как и в «классической» методике происходит под действием тока, но при приближении фрагментов ДНК требуемого размера к месту разветвления, происходит переключение катодов, и искомый фрагмент попадает в боковое ответвление капилляра и собирается в канале для сборки. Для проведения электрофореза нуклеиновых кислот используется Tris-TAPS (или Трис-ТАПС) буфер, для белков — SDS-буфер. Программное обеспечение определяет время элюирования на основе миграции ДНК-маркера.
4 режима программирования:
- Tight (узкий) – сбор коротких фрагментов образца, выбирается в основном для работы с молекулами небольших размеров.
- Range (диапазон) – пользователь может сам выбрать диапазон размера фракций который ему необходим. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.
- Time (время) – коллекционирование образцов происходит в зависимости от заданного времени. Подход используется, когда не важна высокая точность исследования.
- Peak (пик) – сбор пиков (нескольких фрагментов разного размера).
3 стратегии детектирования фракций:
- Для ДНК малых размеров (90 п.н. -1,5 тыс.п.н.): стратегия без окрашивания с внутренними флуоресцентно-мечеными маркерами. В качестве внутренних стандартов используются флуоресцентно-меченые маркеры ДНК, определенной молекулярной массы. Добавляются в лунку совместно с исследуемым образцом. Одновременно возможен анализ 5 образцов.
- Для ДНК больших размеров (> 2 тыс. п.н.): стратегия без окрашивания с внешним флуоресцентно-меченым маркером. В качестве внешнего стандарта используется флуоресцентно-меченый маркер ДНК определённой молекулярной массы, добавляется в отдельную лунку. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.
- Для выделения ДНК с дорожки (band capture) (> 2 тыс. п.н.): окрашивание образцов флуоресцентным красителем Midori Green. Образцы окрашиваются флуоресцентным красителем Midori Green. Одновременно возможен анализ 4 образцов + 1 внешний стандарт.
Преимущества метода:
- Время подготовки — 3 минуты, время проведения самой процедуры — 50-100 мин в зависимости от размеров фрагментов.
- Благодаря готовым гелевым чипам достигается максимальная воспроизводимость экстракции и, как следствие, более точный результат секвенирования.
- Каналы, в которых идёт разгонка, полностью изолированы друг от друга, что снижает риск перекрёстной контаминации.
- Отбор осуществляется, автоматически в соответствии с заданным через ПО диапазоном длин фрагментов, что может использоваться для секвенирования спаренных концов.
- Отбор образцов из пробоотборной камеры производится вручную с помощью стандартного дозатора.
Схема работы:
- Пробоподготовка: подготовка материала, если используются внутренние стандарты: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл флуоресцентно — меченного маркера. Подготовка материала, если используется внешний стандарт: образец ДНК довести до 30 мкл ТЕ буфером, добавить 10 мкл загрузочного раствора. 40 мкл готового стандарта помещается в отдельную дорожку. В случае с красителем Midori Green, 40 мкл красителя помещается в каждую из пяти + буферную камеру и при включении тока будет двигаться на встречу образцам.
- Эксперимент: выбираем картридж в соответствии со стратегией, с помощью которой будет производиться детектирование НК; помещаем картридж в прибор и выбираем её в ПО из списка предложенных программой (ПО само установит все необходимые параметры для проведения электрофореза под выбранный картридж). По истечении времени, заданного программой, образец аккуратно собираем из коллектора фракций пипеточным дозатором.
