За последние 20 лет использование наборов для самых разных приложений в биологических науках значительно возросло. Протоколы, которые заменяют эти наборы, часто отнимают много времени, а иногда и опасны. Использование наборов сделало анализ простым и надежным. Одной из областей, где наборы часто используется, является флуоресцентная маркировка антител.
О выборе наборов антител, о том, какой контроль качества ожидать от поставщика, и какие меры проверки вам могут потребоваться после использования набора выясним в этой статье.
Для чего вам может понадобиться набор для определения антител?
Во многих сферах применения на основе антител, таких как вестерн-блотинг/иммуноблоттинг (лабораторный метод молекулярной биологии, используемый для обнаружения, анализа и количественной оценки специфических белков в образце), используется первичное антитело, которое напрямую связывается с целевым белком. Для визуализации мишени используется вторичное антитело, помеченное флуоресцентным красителем, для связывания первичного антитела, создавая сэндвич с первичным антителом между целевым белком и вторичным антителом.
Для таких сфер применения, как проточная цитометрия, исследователи не используют вторичное антитело. В таких случаях у клиентов есть уникальное антитело, которое не продается и не маркируется выбранным красителем. Наборы дают им возможность легко создавать флуоресцентно маркированные антитела, следуя простым инструкциям. Кроме того, с ростом акцента на мультиплексировании в экспериментах пользователи работают с панелями из нескольких антител, все они с различными визуальными метками. Использование набора позволяет максимально настроить планирование таких экспериментов.
На какие меры контроля качества следует обращать внимание?
Набор хорош настолько, насколько хороша инструкция пользователя. Для каждого набора должны быть четко определены параметры. Эти параметры должны указывать количество антител, для маркировки которых он оптимизирован, и какие диапазоны размеров подходят для этапа очистки.
Просмотрите литературу от поставщика и рассмотрите условия (например, pH), которым будет подвергаться антитело при использовании набора. Используйте знание этих условий, чтобы определить, как это может повлиять на ваш эксперимент или чувствительность антитела, и выберите набор, наиболее подходящий для вашего антитела. Еще одна вещь, на которую следует обратить внимание, — это ссылки, показывающие, что набор успешно использовался другими — в новом наборе их может не быть, но если нет данных для более старого продукта — это повод задуматься.
Каковы преимущества использования набора антител?
Наборы просты и понятны, и их результат быстрее, чем отправлять антитело для маркировки компанией. Они говорят вам, сколько и когда добавлять каждый компонент, все они предоставлены в коробке. Использование набора помогает ученым перейти к реальной работе, а не тратить время на разработку методов и создание компонентов. Это эффективно, просто и это будет работать, вероятно, в 95 процентах случаев.
Что следует учитывать руководителю лаборатории при покупке наборов антител?
Выберите правильный инструмент для работы. Многих проблем можно избежать, если заранее спланировать. Вот некоторые вещи, которые следует учитывать:
- Сколько у вас антител? Существуют наборы, предназначенные для разных количеств антител. Вам понадобится набор в зависимости от массы, которую нужно пометить. Не используйте неправильный набор, иначе он не сработает.
- Где в настоящее время хранятся ваши антитела? Очищенные антитела можно легко пометить с помощью аминореактивной химии, в то время как антитела с белками-носителями в средах или асцитах требуют иного подхода. Для достижения наилучших результатов следует очистить антитело перед его маркировкой, если это возможно.
- Какой цвет вам нужен? Поскольку исследователи переходят на мультиплексные панели, где в одном образце необходимо визуализировать множество различных целей, цвет каждой метки необходимо рассматривать с точки зрения всего эксперимента.
- Какой уровень экспрессии является вашей целью? Уровень экспрессии вашей цели будет влиять на флуорофор, который вы используете для маркировки вашего антитела. Вы можете использовать самый яркий флуорофор на самой низкой экспрессирующей цели. Планируйте свои эксперименты с учетом того, сколько каналов вам понадобится и ожидаемых уровней экспрессии для каждой цели. Просмотрите каталог выбранного производителя, чтобы определить, какие красители соответствуют желаемым длинам волн.
Как вы ухаживаете за комплектом, когда он у вас есть?
Обратите особое внимание на условия хранения компонентов набора. Некоторые наборы содержат компоненты, которые следует хранить в холодильнике, но часть из них следует хранить в морозильной камере. Неправильное хранение может испортить компоненты.
Какие шаги по проверке должен предпринять пользователь после маркировки антител?
При покупке готовых антител большую часть работы по проверке выполняет производитель. Они также должны сообщить вам, для каких целей тестировалось антитело. Однако, когда вы маркируете свои собственные антитела, вам придется проделать часть этой работы самостоятельно.
Обычно меченое антитело характеризуют, чтобы определить степень маркировки и концентрацию меченого антитела с использованием поправочного коэффициента, предоставленного поставщиком. После этого его необходимо протестировать на платформе пользователя, чтобы убедиться, что оно по-прежнему специфически связывается с антигеном. В редких случаях антитела могут терять связывающую авидность.
Если маркировка слишком высокая, вы, вероятно, увидите неспецифическое окрашивание, что приведет к высокому фону. Если маркировка слишком низкая, немаркированное антитело вытеснит маркированное антитело, и ваш сигнал будет тусклым. Разобраться с этими проблемами может быть сложно, но всегда можно обратиться к производителю.
Каковы риски и недостатки использования набора антител?
В некоторых обстоятельствах часть или вся авидность антитела может быть утрачена после маркировки. Обычно это происходит, когда флуорофор находится в месте связывания. Если это происходит с вашим антителом, существуют наборы, которые не полагаются на случайную маркировку.
Если вы проводите пилотный эксперимент, может быть нелегко масштабировать его до большего сопряжения. У производителя должны быть эксперты, которые будут рады помочь вам разобраться, как масштабировать его с помощью их наборов.
Есть ли какие-то захватывающие перспективы в разработке наборов антител?
Нобелевская премия по химии 2022 года была присуждена за открытие «химии щелчков». Было обнаружено, что сложные молекулы можно легко создавать, используя принципы, похожие на принципы Лего или ИКЕА — модули можно соединять вместе с помощью простых реакций «щелчков», создавая большие сложные структуры из более мелких субъединиц.
Такая химия с энтузиазмом принимается для быстрого и легкого создания дизайнерских молекул, включая антитела. Можно спроектировать, где должна быть реактивная группа, и, в основном, по желанию, поместить ее туда с помощью клик-химии.
